一、为何选择大肠杆菌做“侦察兵”
病人、病畜或带菌者的粪便中，病原菌数量稀少且培养条件苛刻，直接检测如同大海捞针。大肠杆菌却与粪便“形影不离”，且培养方法成熟、特征明显。我国《生活饮用水卫生标准》明确规定：每升饮用水中大肠杆菌不得超过3个，超过此限值即提示水体可能存在肠道致病菌，必须立即采取消毒或停供措施。
二、滤膜法思路——让液体过去，把细菌留下
核心工具是一张孔径0.45 μm的醋酸纤维滤膜。大肠杆菌直径约1 μm，无法穿膜；在负压作用下，水样迅速通过，菌体被截留。将膜直接贴在含伊红美蓝（EMB）的选择培养基上，37℃孵育20–24小时，目标菌分解乳糖产酸，与染料形成黑色或紫黑色金属光泽菌落，一眼可辨。
叁、六步闭环操作（现场可移动式）
膜前处理——叁次“热水浴”
将滤膜置于烧杯，加蒸馏水沸煮15 min，换水再重复两次，每次换水前轻摇2–3次，彻底去除膜内残留溶剂和抑菌剂，避免抑制菌落生长。
滤器灭菌——火焰＋高压双保险
金属滤器可用酒精棉球火焰灭菌3圈；若时间充裕，用纱布＋牛皮纸包裹，121℃高压蒸汽灭菌20 min，冷却后立即使用，保证无菌环境。
负压抽滤——-0.4 bar的“瞬间捕捉”
用无菌镊子夹膜边缘，粗糙面朝上，平铺于滤器底座；旋紧漏斗，倒入水样，开启真空泵维持-0.4 bar（约-40 kPa）。样液流尽后再抽气5秒，确保膜面无明显液体残留，减少菌落扩散。
贴膜培养——“零气泡”原则
镊子夹膜迅速转移至EMB平板，截留面向上，完全贴合培养基，禁止夹入空气；同一水样平行做2–3皿，倒置放入37℃恒温箱，20–24 h后观察。
菌落识别——黑色即目标
大肠杆菌在贰惭叠上呈黑色或紫黑色，金属光泽明显；其他非乳糖发酵菌为无色或淡粉色。只计黑色菌落，避免误判。
结果计算——一分钟出数
公式：（平均黑点数 × 稀释倍数）÷ 取样体积（mL）= 大肠杆菌群数（CFU/mL）。
稀释思路：预计菌量>100 CFU时，用无菌水做10倍系列稀释，确保单皿菌落30–300_x0008__x0008_之间，误差最小。
四、快速记忆口诀
“膜煮叁遍→器火灭菌→负压抽干→零气泡贴膜→37℃孵黑→数点报数”——六步连贯，粪便污染指示菌一膜了然。
五、常见陷阱提示
膜面残留液体：导致菌落扩散成条带，需延长抽气时间。
培养基干裂：平板预先回温，避免膜与基面脱离。
稀释不够：黑点数&驳迟;300，需回炉重做10倍稀释。
火焰灭菌未冷却：热滤器烫膜，孔径变形，细菌穿膜而过。
掌握以上细节，即可在户外移动实验室完成“取样-培养-计数”全程，30分钟动手，20小时孵育，1分钟读数，轻松实现饮用水、海水、废水的大肠杆菌群快速监测。
本文标题：黑点小宇宙滤膜法一分钟计数粪便指示菌从火焰灭菌到负压抽滤的全程速记
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